Új koronavírus (SARS-Cov-2) nukleinsav-észlelő készlet
New Coronavirus(SARS-Cov-2) Nucleic Acid Detection Kit
(Fluércscent RT-PCR Probe Method) Product Manual
【Product name 】Új koronavírus (SARS-Cov-2) nukleinsav-detektáló készlet (fluoreszcens RT-PCR szonda módszer)
【Packaging specifications 】25 Teszt/Kit
【Intended uskor】
Ez a készlet az új koronavírusból származó nukleinsav kvalitatív kimutatására szolgál orrgarat-, száj-garat- (torok-) tamponokból, elülső orrtamponokból, középső turbinájú tamponokból, orröblítésekből és orrszívókból olyan személyektől, akiknél COVID19-gyanús. Az új koronavírus ORF1ab és N gének kimutatása felhasználható az új koronavírus fertőzés kisegítő diagnosztikájára és epidemiológiai monitorozására.
【Principles of the prózsadure 】
Ez a készlet specifikus TaqMan próbákhoz és specifikus primerekhez készült, amelyeket az új koronavírus (SARS-Cov-2) ORF1ab és N génszekvenciákhoz terveztek. A PCR reakcióoldat 3 specifikus primer-készletet és fluoreszcens próbát tartalmaz a célpontok specifikus kimutatására, és egy további specifikus primer- és fluoreszcens próbát használnak a kit belső standard kontrolljaként az endogén háztartási gének kimutatására.
A vizsgálat elve az, hogy a specifikus fluoreszcens szondát a Taq enzim exonukleáz aktivitása emészti fel és lebontja a PCR-reakcióban, így a riporter fluoreszcens csoport és a kioltott fluoreszcens csoport elválik, így a fluoreszcens mérőrendszer fluoreszcens sugárzást tud fogadni. jelet, majd A PCR amplifikáció dúsító hatása révén a próba fluoreszcencia jele elér egy beállított küszöbérték-Ct értéket (Cycle threshold). Ha nincs célamplikon, a próba riportercsoportja közel van a kioltó csoporthoz. Ekkor megtörténik a fluoreszcens rezonancia energiaátvitel, és a riportercsoport fluoreszcenciáját a kioltó csoport kioltja, így a fluoreszcens jelet a fluoreszcens PCR készülék nem tudja kimutatni.
A teszt során a reagensek használatának monitorozása érdekében a kit pozitív és negatív kontrollokkal van felszerelve: a pozitív kontroll a célhely rekombináns plazmidját tartalmazza, a negatív kontroll pedig a desztillált víz, amely a környezetszennyezés monitorozására szolgál. A tesztelés során javasolt egy pozitív és egy negatív kontroll egyidejű beállítása.
【Main components 】
Cat. No. | BST-SARS-25 | BST-SARS-DR-25 | Component | |
Name | Specification | Quantity | Quantity | |
Pozitív kontroll | 180 μl/fiola | 1 | 1 | Mesterségesen előállított plazmidok, desztillált víz |
Negatív kontroll | 180 μl/fiola | 1 | 1 | Desztillált víz |
SARS-Cov-2 keverék | 358,5 μL/fiola | 1 | / | Specifikus primer párok, specifikus detektáló fluoreszcens szondák, dNTP-k, , MgCl2, KCl, Tris-Hcl, desztillált víz stb. |
Enzimkeverék | 16,5 μl/fiola | 1 | / | Taq enzimek, reverz transzkriptáz, UNG enzimek stb. |
SARS-Cov-2 keverék (liofilizált) | 25 teszt/fiola | / | 1 | Specifikus primer párok, specifikus detektáló fluoreszcens próbák, dNTP-k, Taq enzimek, reverz transzkriptáz, desztillált víz stb. |
2x puffer | 375 μl/fiola | / | 1 | MgCl2, KCl, Tris-Hcl, desztillált víz stb. |
Jegyzet:(1) A különböző kötegkészletekben lévő komponensek nem keverhetők vagy cserélhetők fel.
(2) Készítse elő saját reagensét: Nukleinsav extrakciós készlet.
【Storage conditions és expiration date 】
For BST-SARS-25:Szállítás és tárolás -20±5°C-on hosszú ideig.
For BST-SARS-DR-25:Szállítás szobahőmérsékleten. Hosszú ideig -20±5°C-on tárolandó.
Kerülje az ismételt fagyasztási-olvadási ciklusokat. Az érvényességi idő előzetesen 12 hónap.
A gyártás és a felhasználás dátumát lásd a címkén.
Az első felnyitás után a reagens -20±5 °C-on legfeljebb 1 hónapig vagy a reagens periódus végéig tárolható, attól függően, hogy melyik időpont előbb következik be, hogy elkerüljük az ismételt fagyasztás-olvasztás ciklusokat és a reagens lefagyások számát. - a kiolvasztási ciklusok nem haladhatják meg a 6-szorost.
【Applicable instrument】ABI 7500, SLAN-96P, Roche-LightCycler-480.
【Sample requirements 】
1.Alkalmazandó mintatípus: Extrakciós nukleinsav oldat.
2. A minták tárolása és szállítása: Tárolja -20±5 ℃-on 6 hónapig. Fagyassza le és olvassa fel a mintákat legfeljebb 6 alkalommal.
【Testing method】
1.Nucleic acid extraction
Válasszon ki egy megfelelő nukleinsav extrakciós készletet a vírusos nukleinsav extrakciójához, és kövesse a megfelelő készlet utasításait. Javasoljuk, hogy a Yixin Bio-Tech (Guangzhou) Co., Ltd. által gyártott nukleinsav extrakciós és tisztító készletet vagy ezzel egyenértékű nukleinsavtisztító készletet használjon.
2. Reaction reagent preparation
2.1 For BST-SARS-25:
(1) Távolítsa el a SARS-Cov-2 keveréket és az enzimkeveréket, szobahőmérsékleten teljesen megolvadjon, alaposan keverje össze Vortex eszközzel, majd röviden centrifugálja.
(2) 16,5 ul enzimkeveréket adtunk 358,5 ul SARS-Cov-2 keverékhez, és alaposan összekevertük, hogy megkapjuk a kevert reakcióoldatot.
(3) Készítsen elő egy tiszta 0,2 ml-es PCR oktális csövet, és jelölje meg lyukanként 15 uL fenti kevert reakcióoldattal.
(4) Adjon hozzá 15 μL tisztított nukleinsavoldatot, a pozitív és a negatív kontrollt, és óvatosan fedje le az oktális cső kupakját.
(5) Fejjel lefelé fordítva alaposan keverje össze, és gyorsan centrifugálja, hogy a folyadék a cső alján koncentrálódjon.
1
2.2 For BST-SARS-DR-25:
(1) Adjon hozzá 375 ul 2x puffert a SARS-Cov-2 keverékhez ((liofilizált) a reakcióelegy elkészítéséhez. Pipettázással alaposan keverje össze, majd röviden centrifugálja. (A reakciókeverék elkészítése után ajánlatos -20 ℃ hőmérsékleten tárolni. hosszú távú tárolás.)
(2) Készítsen elő egy tiszta 0,2 ml-es PCR oktális csövet, és jelölje meg 15 μl reakciókeverékkel lyukanként.
(3) Adjon hozzá 15 μL tisztított nukleinsavoldatot, a pozitív és a negatív kontrollt, és óvatosan fedje le az oktális cső kupakját.
(4) Fejjel lefelé fordítva alaposan keverje össze, és gyorsan centrifugálja, hogy a folyadék a cső alján koncentrálódjon.
3. PCR amplification (A működési beállításokat a készülék kézikönyvében találja.)
3. 1 Helyezze a PCR 8 csövet a fluoreszcens PCR műszer mintakamrájába, és állítsa be a vizsgálandó mintát, a pozitív kontrollt és a negatív kontrollt a töltés sorrendjének megfelelően.
3.2 Fluoreszcencia érzékelési csatorna:
(1) Az ORF1ab gén kiválasztja a FAM kimutatási csatornáját (Riporter: FAM, Quencher: Nincs).
(2) Az N gén kiválasztja a VIC kimutatási csatornáját (Reporter: VIC, Quencher: Nincs).
(3) A belső standard gén kiválasztja a CY5 kimutatási csatornáját (Reporter: CY5, Quencher: Nincs).
(4) A passzív referencia ROX-ra van állítva.
3.3 A PCR program paramétereinek beállítása:
Lépés | Hőmérséklet (℃) | Idő | Ciklusok száma | |
1 | Fordított transzkripciós reakció | 50 | 15 perc | 1 |
2 | Taq enzim aktiválása | 95 | 2,5 perc | 1 |
3 | Taq enzim aktiválása | 93 | 10 s | 43 |
A lágyítás kiterjesztése és a fluoreszcencia felvétele | 55 | 30 s |
A beállítás után mentse el a fájlt és futtassa a reakcióprogramot.
4.Results analysis
A program lejárta után az eredmények automatikusan mentésre kerülnek, és az erősítési görbe elemzésre kerül. Az erősítési görbe a műszer alapértelmezett küszöbére van állítva.
【Explanation of test results 】
1. Határozza meg a kísérlet érvényességét: A pozitív kontroll FAM, VIC csatornának tipikus amplifikációs görbével kell rendelkeznie, és a Ct érték általában kisebb, mint 34, de a különböző műszerek eltérő küszöbbeállításai miatt ingadozhat. A negatív kontroll FAM, VIC csatornának nem erősített Ct-nek kell lennie. Megállapodtak abban, hogy a fenti követelményeknek egyidejűleg kell teljesülniük, ellenkező esetben ez a teszt érvénytelen.
2. Eredményítélet
FAM/VIC csatorna | Ítélet eredménye |
Ct<37 | A minta teszt pozitív |
37≤Ct<40 | Az amplifikációs görbe S alakú, és a gyanús mintákat újra meg kell vizsgálni; ha az ismételt vizsgálati eredmények konzisztensek, akkor pozitívnak, ellenkező esetben negatívnak minősül |
Ct≥40 vagy nincs erősítés | A minta tesztje negatív (vagy a készlet kimutatásának alsó határa alatt van) |
Megjegyzés: (1) Ha a FAM csatorna és a VIC csatorna egyidejűleg pozitív, akkor a SARS-Cov-2 pozitív.
(2) Ha a FAM-csatorna vagy a VIC-csatorna pozitív, a másik csatorna pedig negatív, a tesztet meg kell ismételni. Ha egyidejűleg pozitív, akkor SARS-Cov-2 pozitívnak, ellenkező esetben SARS-Cov-2 negatívnak minősül.